Interferencia faktorok PCR reakciókban

A PCR reakció során gyakran előfordulnak zavaró tényezők.
A PCR nagyon magas érzékenysége miatt a szennyeződést a PCR-eredményeket befolyásoló egyik legfontosabb tényezőnek tekintik, és álpozitív eredményeket okozhat.
Ugyanilyen kritikusak a különféle források, amelyek álnegatív eredményekhez vezetnek. Ha a PCR-keverék vagy maga az amplifikációs reakció egy vagy több lényeges része gátolt vagy zavart szenved, az akadályozhatja a diagnosztikai vizsgálatot. Ez a hatékonyság csökkenéséhez és akár álnegatív eredményekhez is vezethet.
A gátláson kívül a célnukleinsav integritásának elvesztése a minta előkészítése előtti szállítási és/vagy tárolási körülmények miatt is előfordulhat. Különösen a magas hőmérséklet vagy a nem megfelelő tárolás vezethet a sejtek és a nukleinsavak károsodásához. A sejtek és szövetek fixálása, valamint a paraffinba ágyazódás a DNS-fragmentáció jól ismert okai és állandó probléma (lásd az 1. és 2. ábrát). Ezekben az esetekben még az optimális izolálás és tisztítás sem segít.

1. ábra | Az immobilizáció hatása a DNS integritására
Az agaróz gélelektroforézis kimutatta, hogy a boncolások paraffinos metszeteiből izolált DNS minősége jelentősen változott. A fixálási módszertől függően különböző átlagos fragmentumhosszúságú DNS volt jelen a kivonatokban. A DNS csak natív fagyasztott mintákban és pufferolt semleges formalinban fixálva konzerválódott. Erősen savas Bouin-fixáló vagy puffer nélküli, hangyasavat tartalmazó formalin használata jelentős DNS-veszteséget eredményezett. A fennmaradó frakció erősen fragmentálódott.
A bal oldalon a fragmensek hossza kilobázispárokban (kbp) van kifejezve.

2. ábra | Nukleinsav-célpontok integritásának elvesztése
(a) Mindkét szálon lévő 3′-5′ rés törést eredményez a célzott DNS-ben. A DNS szintézise továbbra is megtörténik a kis fragmentumon. Ha azonban a DNS-fragmentumról hiányzik egy primer kötődési hely, akkor csak lineáris amplifikáció történik. A legkedvezőbb esetben a fragmensek újra telíthetik egymást, de a hozamok kicsik lesznek, és a kimutatási szint alatt lesznek.
(b) A bázisok elvesztése, főként a depurináció és a timidin dimer képződése miatt, a H-kötések számának csökkenéséhez és a Tm csökkenéséhez vezet. A megnyújtott felmelegedési fázis alatt a primerek elolvadnak a mátrix DNS-től, és még kevésbé szigorú körülmények között sem kötődnek egymáshoz.
(c) A szomszédos timinbázisok TT dimert alkotnak.
Egy másik gyakori probléma a molekuláris diagnosztikában a célnukleinsavak optimálisnál gyengébb felszabadulása a fenol-kloroform extrakcióhoz képest. Szélsőséges esetekben ez álnegatív eredményekkel járhat. Sok időt lehet megtakarítani a sejttörmelék forrásban lévő lízisével vagy enzimatikus emésztésével, de ez a módszer gyakran alacsony PCR-érzékenységet eredményez a nem megfelelő nukleinsav-felszabadulás miatt.

A polimeráz aktivitás gátlása az amplifikáció során

Általánosságban elmondható, hogy a gátlást egyfajta konténerfogalomként használják minden olyan tényező leírására, amely szuboptimális PCR-eredményekhez vezet. Szigorúan biokémiai értelemben a gátlás az enzim aktivitására korlátozódik, azaz csökkenti vagy megakadályozza a szubsztrát-termék átalakulást a DNS-polimeráz vagy kofaktorának aktív helyével való kölcsönhatás révén (pl. Mg2+ a Taq DNS-polimeráz esetében).
A mintában lévő komponensek vagy a reagenseket tartalmazó különféle pufferek és kivonatok közvetlenül gátolhatják az enzimet, vagy csapdába ejthetik kofaktorait (pl. EDTA), ezáltal inaktiválva a polimerázt, és ezáltal csökkent vagy álnegatív PCR-eredményekhez vezethetnek.
A reakciókomponensek és a célpontot tartalmazó nukleinsavak közötti számos kölcsönhatást azonban „PCR-gátlóknak” is nevezik. Amint a sejt integritása megsérül az izolálással, és a nukleinsav felszabadul, kölcsönhatások léphetnek fel a minta és a környező oldat, illetve szilárd fázis között. Például a „gyökérmentesítők” nem kovalens kölcsönhatásokon keresztül kötődhetnek az egy- vagy kétszálú DNS-hez, és zavarhatják az izolálást és a tisztítást azáltal, hogy csökkentik a PCR-reakcióedénybe végül eljutó célpontok számát.
Általánosságban elmondható, hogy a PCR-gátlók a legtöbb testnedvben és klinikai diagnosztikai vizsgálatokhoz használt reagensben (karbamid a vizeletben, hemoglobin és heparin a vérben), étrend-kiegészítőkben (szerves komponensek, glikogén, zsír, Ca2+ ionok) és a környezetben található komponensekben (fenolok, nehézfémek) jelen vannak.

A gyakoribb PCR-gátlók baktériumokban és eukarióta sejtekben, nem célzott DNS-ben, szöveti mátrixok DNS-kötő makromolekuláiban, valamint laboratóriumi eszközökben, például kesztyűkben és műanyagokban találhatók. A PCR-gátlók eltávolításának előnyben részesített módszere a nukleinsavak tisztítása az extrakció során vagy után.
Napjainkban számos automatizált extrakciós berendezés képes helyettesíteni számos manuális protokollt, de a célpontok 100%-os kinyerését és/vagy tisztítását soha nem érték el. A potenciális inhibitorok továbbra is jelen lehetnek a tisztított nukleinsavakban, vagy már hathattak is. Különböző stratégiák léteznek az inhibitorok hatásának csökkentésére. A megfelelő polimeráz megválasztása jelentős hatással lehet az inhibitor aktivitására. A PCR-gátlás csökkentésére szolgáló egyéb bevált módszerek a polimeráz koncentrációjának növelése vagy adalékanyagok, például a BSA alkalmazása.
A PCR-reakciók gátlását belső folyamatminőség-ellenőrzéssel (IPC) lehet kimutatni.
Ügyelni kell arra, hogy az extrakciós készletben található összes reagenst és egyéb oldatot, például az etanolt, EDTA-t, CETAB-ot, LiCl-t, GuSCN-t, SDS-t, izopropanolt és fenolt alapos mosással távolítsuk el a nukleinsav-izolátumból. Koncentrációjuktól függően aktiválhatják vagy gátolhatják a PCR-t.