Interferenciafaktorok a PCR reakciókban

A PCR reakció során gyakran találkozunk néhány zavaró tényezővel.
A PCR nagyon nagy érzékenysége miatt a szennyeződést tartják a PCR eredményeket befolyásoló egyik legfontosabb tényezőnek, és hamis pozitív eredményeket produkálhat.
Ugyanilyen kritikusak azok a különféle források, amelyek hamis-negatív eredményekhez vezetnek. Ha a PCR keverék egy vagy több lényeges része vagy magát az amplifikációs reakciót gátolják vagy zavarják, a diagnosztikai vizsgálat akadályozható. Ez csökkenti a hatékonyságot és akár hamis negatív eredményeket is okozhat.
A gátláson kívül a célnukleinsav integritásának elvesztése is előfordulhat a minta-előkészítést megelőző szállítási és/vagy tárolási körülmények miatt. Különösen a magas hőmérséklet vagy a nem megfelelő tárolás vezethet a sejtek és a nukleinsavak károsodásához. A sejt- és szövetrögzítés, valamint a paraffin beágyazódás jól ismert okai a DNS-fragmentációnak és állandó probléma (lásd 1. és 2. ábra). Ezekben az esetekben még az optimális elkülönítés és tisztítás sem segít.

1. ábra | Az immobilizáció hatása a DNS integritására
Az agaróz gélelektroforézis azt mutatta, hogy a boncolások paraffin metszeteiből izolált DNS minősége jelentősen változott. A fixálási módtól függően eltérő átlagos fragmentumhosszúságú DNS volt jelen a kivonatokban. A DNS csak akkor őrizhető meg, ha natív fagyasztott mintákban és pufferolt semleges formalinban rögzítették. Erősen savas Bouin fixáló vagy nem pufferolt, hangyasav tartalmú formalin alkalmazása jelentős DNS veszteséget eredményezett. A fennmaradó frakció erősen töredezett.
A bal oldalon a töredékek hosszát kilobázispárban (kbp) fejezzük ki.

2. ábra | A nukleinsav célpontok integritásának elvesztése
(a) A 3′-5′ rés mindkét szálon a cél DNS törését eredményezi. a DNS szintézise továbbra is megtörténik a kis fragmenten. Ha azonban a DNS-fragmensen hiányzik egy primer-illesztési hely, akkor csak lineáris amplifikáció történik. A legkedvezőbb esetben a fragmentumok újratelíthetik egymást, de a hozam kicsi és a kimutatási szint alatt van.
(b) A bázisok elvesztése, elsősorban a depurináció és a timidin dimer képződés miatt, a H-kötések számának csökkenéséhez és a Tm csökkenéséhez vezet. Az elnyújtott melegítési fázis során a primerek elolvadnak a mátrix DNS-től, és még kevésbé szigorú körülmények között sem kapcsolódnak össze.
(c) A szomszédos timinbázisok TT dimert alkotnak.
A molekuláris diagnosztikában gyakran előforduló másik gyakori probléma a célnukleinsavak kevésbé optimális felszabadulása a fenol-kloroformos extrakcióhoz képest. Szélsőséges esetekben ez hamis negatív eredménnyel járhat. Sok idő takarítható meg a forrásban lévő lízissel vagy a sejttörmelék enzimes emésztésével, de ez a módszer gyakran alacsony PCR-érzékenységet eredményez az elégtelen nukleinsav-felszabadulás miatt.

A polimeráz aktivitás gátlása az amplifikáció során

Általában a gátlást tartályfogalomként használják minden olyan tényező leírására, amely szuboptimális PCR-eredményekhez vezet. Szigorúan biokémiai értelemben a gátlás az enzim aktivitására korlátozódik, azaz csökkenti vagy megakadályozza a szubsztrát-termék átalakulást a DNS polimeráz aktív helyével vagy kofaktorával (pl. Mg2+ a Taq DNS polimeráz esetében) való kölcsönhatás révén.
A mintában lévő komponensek vagy a reagenseket tartalmazó különféle pufferek és kivonatok közvetlenül gátolhatják az enzimet, vagy befoghatják kofaktorait (pl. EDTA), ezáltal inaktiválják a polimerázt, ami csökkent vagy hamis negatív PCR eredményekhez vezethet.
A reakciókomponensek és a célpontot tartalmazó nukleinsavak közötti sok kölcsönhatást azonban „PCR-inhibitornak” is nevezik. Miután a sejt integritását az izolálás megzavarta, és a nukleinsav felszabadul, kölcsönhatás léphet fel a minta és a környező oldat, valamint a szilárd fázis között. Például a „scavengerek” megköthetik az egy- vagy kétszálú DNS-t nem kovalens kölcsönhatások révén, és megzavarhatják az izolálást és a tisztítást azáltal, hogy csökkentik a célpontok számát, amelyek végül elérik a PCR reakcióedényt.
Általánosságban elmondható, hogy a PCR-inhibitorok a legtöbb testnedvben és klinikai diagnosztikai vizsgálatokhoz használt reagensben (karbamid a vizeletben, hemoglobin és heparin a vérben), étrend-kiegészítők (szerves komponensek, glikogén, zsír, Ca2+-ionok) és környezeti összetevők (fenolok, nehézfémek) jelen vannak.

Elterjedtebb PCR-inhibitorok találhatók baktériumokban és eukarióta sejtekben, nem cél DNS-ben, szöveti mátrixok DNS-kötő makromolekuláiban és laboratóriumi berendezésekben, például kesztyűben és műanyagokban. A nukleinsavak tisztítása az extrakció alatt vagy után az előnyös módszer a PCR-inhibitorok eltávolítására.
Manapság a különféle automatizált extrakciós berendezések sok manuális protokollt helyettesíthetnek, de a célpontok 100%-os helyreállítása és/vagy tisztítása még soha nem sikerült. A lehetséges inhibitorok még mindig jelen lehetnek a tisztított nukleinsavakban, vagy már hatottak. Különféle stratégiák léteznek az inhibitorok hatásának csökkentésére. A megfelelő polimeráz kiválasztása jelentős hatással lehet az inhibitor aktivitásra. A PCR-gátlás csökkentésének egyéb bevált módszerei a polimerázkoncentráció növelése vagy adalékok, például a BSA alkalmazása.
A PCR-reakciók gátlása a belső folyamatminőség-ellenőrzés (IPC) alkalmazásával igazolható.
Gondoskodni kell arról, hogy az extrakciós készletben lévő összes reagenst és egyéb oldatot, például etanolt, EDTA-t, CETAB-ot, LiCl-t, GuSCN-t, SDS-t, izopropanolt és fenolt eltávolítsák a nukleinsav-izolátumból egy alapos mosási lépéssel. Koncentrációjuktól függően aktiválhatják vagy gátolhatják a PCR-t.