Interferencia tényezők a PCR reakciókban

A PCR -reakció során néhány zavaró tényezőt gyakran fordulnak elő.
A PCR nagyon magas érzékenysége miatt a szennyeződést a PCR -eredményeket befolyásoló egyik legfontosabb tényezőnek tekintik, és hamis pozitív eredményeket hozhatnak.
Ugyanilyen kritikus azok a különféle források, amelyek hamis-negatív eredményekhez vezetnek. Ha a PCR keverék egy vagy több alapvető részét vagy az amplifikációs reakciót gátolják vagy beavatkoznak, akkor a diagnosztikai vizsgálat akadályozható. Ez csökkentett hatékonysághoz és akár hamis negatív eredményekhez is vezethet.
A gátlás mellett a cél nukleinsav integritásának elvesztése előfordulhat a minta előkészítése előtti szállítási és/vagy tárolási feltételek miatt. Különösen a magas hőmérséklet vagy a nem megfelelő tárolás a sejtek és a nukleinsavak károsodásához vezethet. A sejt- és szöveti rögzítés és a paraffin beágyazása a DNS -fragmentáció és a tartós probléma ismert okai (lásd az 1. és 2. ábrát). Ezekben az esetekben még az optimális elszigetelés és a tisztítás sem segít.

1. ábra | Az immobilizáció hatása a DNS -integritásra
Az agaróz gélelektroforézis azt mutatta, hogy a boncolási paraffinszakaszokból izolált DNS minősége jelentősen eltérő volt. A rögzítési módszertől függően különböző átlagos fragmenshosszú DNS volt jelen az extraktumokban. A DNS -t csak natív fagyasztott mintákban és pufferolt semleges formalinban rögzítették, ha rögzítették. Az erősen savas bouin rögzítő vagy pufferelhetetlen, hangyasavtartalmú formalin használata jelentős DNS-veszteséget eredményezett. A fennmaradó frakció nagyon széttöredezett.
A bal oldalon a fragmensek hosszát kilobázpárokban (KBP) expresszálják

2. ábra | A nukleinsav -célok integritásának elvesztése
(A) A 3′-5 ′ rés mindkét szálon megszakad a cél DNS-ben. A DNS szintézise továbbra is előfordul a kis fragmentumon. Ha azonban a DNS -fragmentumban hiányzik egy primer lágyító hely, akkor csak lineáris amplifikáció történik. A legkedvezőbb esetben a fragmensek újratelíthetik egymást, de a hozamok kicsik és a detektálási szint alatt vannak.
(B) A bázisok elvesztése, elsősorban a depurináció és a timidin dimer képződése miatt, a H-kötések számának csökkenéséhez és a TM csökkenéséhez vezet. A hosszúkás melegítési szakaszban a primerek elolvadnak a mátrix DNS -től, és még kevésbé szigorú körülmények között sem fognak izzadni.
(C) A szomszédos timinbázisok TT dimert képeznek.
Egy másik általános probléma, amely gyakran a molekuláris diagnosztikában fordul elő, a cél nukleinsavak kevésbé optimális felszabadulása a fenol-kloroform extraháláshoz képest. Szélsőséges esetekben ez társítható hamis negatívokkal. Nagyon sok időt lehet megmenteni a sejt -törmelék lízisével vagy enzimatikus emésztéssel, de ez a módszer gyakran alacsony PCR -érzékenységet eredményez a nem elegendő nukleinsav felszabadulása miatt.

A polimeráz aktivitás gátlása az amplifikáció során

Általánosságban elmondható, hogy a gátlást konténerkoncepcióként használják az összes olyan tényező leírására, amelyek szuboptimális PCR -eredményekhez vezetnek. Szigorúan biokémiai értelemben a gátlás az enzim aktivitására korlátozódik, azaz csökkenti vagy megakadályozza a szubsztráttermék átalakulását a DNS-polimeráz aktív helyével vagy annak kofaktorjával való kölcsönhatás révén (pl. Mg2+ a Taq DNS-polimeráz).
A mintában vagy a különféle pufferekben, valamint a reagenseket tartalmazó extraktumok komponensei közvetlenül gátolhatják az enzimet vagy csapdába ejthetik a kofaktorokat (pl. EDTA), ezáltal inaktiválva a polimerázt, és viszont csökkent vagy hamis negatív PCR -eredményekhez vezetnek.
Ugyanakkor a reakciókomponensek és a céltartalmú nukleinsavak közötti sok kölcsönhatást szintén „PCR-gátlóknak” nevezik. Miután a sejt integritását az izoláció megszakítja, és a nukleinsav felszabadul, a minta és a környező oldat és a szilárd fázis közötti kölcsönhatások előfordulhatnak. Például a „Scavengers” nem kovalens interakciók révén kötheti az egy- vagy kétszálú DNS-t, és zavarhatja az izolációt és a tisztítást azáltal, hogy csökkenti a célok számát, amelyek végül elérik a PCR reakció edényét.
Általánosságban a PCR -gátlók vannak jelen a klinikai diagnosztikai vizsgálatokhoz (a vizeletben, hemoglobinban és heparinban lévő karbamid, glikogén, glikogén, zsír, Ca2+ ionok) és a környezeti komponensek klinikai diagnosztikai tesztjeiben (karbamid, zsír, Ca2+ ionok) és a környezetben (fenolok, nehézfémek) (fenolok, nehézfémek).

Az elterjedtebb PCR-gátlók megtalálhatók a baktériumokban és az eukarióta sejtekben, a nem célzott DNS-ben, a szöveti mátrixok DNS-kötő makromolekuláiban és a laboratóriumi berendezésekben, például kesztyűkben és műanyagokban. A nukleinsavak tisztítása az extrahálás alatt vagy után az előnyben részesített módszer a PCR -gátlók eltávolítására.
Manapság a különféle automatizált extrakciós berendezések sok kézi protokollt helyettesíthetnek, de a célok 100% -os visszanyerését és/vagy tisztítását soha nem sikerült elérni. A potenciális inhibitorok továbbra is jelen lehetnek a tisztított nukleinsavakban, vagy már hatályba léphetnek. Különböző stratégiák léteznek az inhibitorok hatásának csökkentése érdekében. A megfelelő polimeráz megválasztása jelentős hatással lehet az inhibitor aktivitására. A PCR -gátlás csökkentésére szolgáló egyéb bevált módszerek a polimeráz koncentrációjának növelése vagy az adalékanyagok, például a BSA alkalmazása.
A PCR -reakciók gátlása a belső folyamatminőség -ellenőrzés (IPC) használatával bizonyítható.
Vigyázni kell az összes reagens és egyéb oldat eltávolítására az extrakciós készletben, például etanol, EDTA, Cetab, LICL, GUSCN, SDS, izopropanol és fenol, alapos mosási lépéssel a nukleinsav -izolátumból. Koncentrációjától függően aktiválhatják vagy gátolhatják a PCR -t.