Interferenciafaktorok a PCR reakciókban

A PCR reakció során gyakran találkozunk néhány zavaró tényezővel.
A PCR nagyon nagy érzékenysége miatt a szennyeződést tartják a PCR eredményeket befolyásoló egyik legfontosabb tényezőnek, és hamis pozitív eredményeket produkálhat.
Ugyanilyen kritikusak azok a különféle források, amelyek hamis-negatív eredményekhez vezetnek.Ha a PCR keverék egy vagy több lényeges része vagy magát az amplifikációs reakciót gátolják vagy zavarják, a diagnosztikai vizsgálat akadályozható.Ez csökkenti a hatékonyságot és akár hamis negatív eredményeket is okozhat.
A gátláson kívül a célnukleinsav integritásának elvesztése is előfordulhat a minta-előkészítést megelőző szállítási és/vagy tárolási körülmények miatt.Különösen a magas hőmérséklet vagy a nem megfelelő tárolás vezethet a sejtek és a nukleinsavak károsodásához.A sejt- és szövetrögzítés, valamint a paraffin beágyazódás jól ismert okai a DNS-fragmentációnak és állandó probléma (lásd 1. és 2. ábra).Ezekben az esetekben még az optimális elkülönítés és tisztítás sem segít.

1. ábra |Az immobilizáció hatása a DNS integritására
Az agaróz gélelektroforézis azt mutatta, hogy a boncolások paraffin metszeteiből izolált DNS minősége jelentősen változott.A fixálási módtól függően eltérő átlagos fragmentumhosszúságú DNS volt jelen a kivonatokban.A DNS csak akkor őrizhető meg, ha natív fagyasztott mintákban és pufferolt semleges formalinban rögzítették.Erősen savas Bouin fixáló vagy nem pufferolt, hangyasav tartalmú formalin alkalmazása jelentős DNS veszteséget eredményezett.A fennmaradó frakció erősen töredezett.
A bal oldalon a töredékek hosszát kilobázispárban (kbp) fejezzük ki.

2. ábra |A nukleinsav célpontok integritásának elvesztése
(a) A 3′-5′ rés mindkét szálon a cél DNS törését eredményezi.a DNS szintézise továbbra is megtörténik a kis fragmenten.Ha azonban a DNS-fragmensen hiányzik egy primer-illesztési hely, akkor csak lineáris amplifikáció történik.A legkedvezőbb esetben a fragmentumok újratelíthetik egymást, de a hozam kicsi és a kimutatási szint alatt van.
(b) A bázisok elvesztése, elsősorban a depurináció és a timidin dimer képződés miatt, a H-kötések számának csökkenéséhez és a Tm csökkenéséhez vezet.Az elnyújtott melegítési fázis során a primerek elolvadnak a mátrix DNS-től, és még kevésbé szigorú körülmények között sem kapcsolódnak össze.
(c) A szomszédos timinbázisok TT dimert alkotnak.
A molekuláris diagnosztikában gyakran előforduló másik gyakori probléma a célnukleinsavak kevésbé optimális felszabadulása a fenol-kloroformos extrakcióhoz képest.Szélsőséges esetekben ez hamis negatív eredménnyel járhat.Sok idő takarítható meg a forrásban lévő lízissel vagy a sejttörmelék enzimes emésztésével, de ez a módszer gyakran alacsony PCR-érzékenységet eredményez az elégtelen nukleinsav-felszabadulás miatt.

A polimeráz aktivitás gátlása az amplifikáció során

Általában a gátlást tartályfogalomként használják minden olyan tényező leírására, amely szuboptimális PCR-eredményekhez vezet.Szigorúan biokémiai értelemben a gátlás az enzim aktivitására korlátozódik, azaz csökkenti vagy megakadályozza a szubsztrát-termék átalakulást a DNS polimeráz aktív helyével vagy kofaktorával (pl. Mg2+ a Taq DNS polimeráz esetében) való kölcsönhatás révén.
A mintában lévő komponensek vagy a reagenseket tartalmazó különféle pufferek és kivonatok közvetlenül gátolhatják az enzimet, vagy befoghatják kofaktorait (pl. EDTA), ezáltal inaktiválják a polimerázt, ami csökkent vagy hamis negatív PCR eredményekhez vezethet.
A reakciókomponensek és a célpontot tartalmazó nukleinsavak közötti sok kölcsönhatást azonban „PCR-inhibitornak” is nevezik.Miután a sejt integritását az izolálás megzavarta, és a nukleinsav felszabadul, kölcsönhatás léphet fel a minta és a környező oldat, valamint a szilárd fázis között.Például a „scavengerek” megköthetik az egy- vagy kétszálú DNS-t nem kovalens kölcsönhatások révén, és megzavarhatják az izolálást és a tisztítást azáltal, hogy csökkentik a célpontok számát, amelyek végül elérik a PCR reakcióedényt.
Általánosságban elmondható, hogy a PCR-gátlók a legtöbb testnedvben és klinikai diagnosztikai vizsgálatokhoz használt reagensben (karbamid a vizeletben, hemoglobin és heparin a vérben), étrend-kiegészítők (szerves összetevők, glikogén, zsír, Ca2+-ionok) és környezeti összetevők (fenolok) jelen vannak. , nehéz fémek)

Elterjedtebb PCR-inhibitorok találhatók baktériumokban és eukarióta sejtekben, nem cél DNS-ben, szöveti mátrixok DNS-kötő makromolekuláiban és laboratóriumi berendezésekben, például kesztyűben és műanyagokban.A nukleinsavak tisztítása az extrakció alatt vagy után az előnyös módszer a PCR-inhibitorok eltávolítására.
Manapság a különféle automatizált extrakciós berendezések sok manuális protokollt helyettesíthetnek, de a célpontok 100%-os helyreállítása és/vagy tisztítása soha nem valósult meg.A lehetséges inhibitorok még mindig jelen lehetnek a tisztított nukleinsavakban, vagy már hatottak.Különféle stratégiák léteznek az inhibitorok hatásának csökkentésére.A megfelelő polimeráz kiválasztása jelentős hatással lehet az inhibitor aktivitásra.A PCR-gátlás csökkentésének egyéb bevált módszerei a polimerázkoncentráció növelése vagy adalékok, például a BSA alkalmazása.
A PCR-reakciók gátlása a belső folyamatminőség-ellenőrzés (IPC) alkalmazásával igazolható.
Gondoskodni kell arról, hogy az extrakciós készletben lévő összes reagenst és egyéb oldatot, például etanolt, EDTA-t, CETAB-ot, LiCl-t, GuSCN-t, SDS-t, izopropanolt és fenolt eltávolítsák a nukleinsav-izolátumból egy alapos mosási lépéssel.Koncentrációjuktól függően aktiválhatják vagy gátolhatják a PCR-t.