Négy nukleinsav-amplifikációs vizsgálat elvégzése a SARS-CoV-2 azonosítására Etiópiában

Köszönjük, hogy meglátogatta a Nature.com oldalt. Olyan böngészőverziót használ, amely korlátozott CSS-támogatással rendelkezik. A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon frissített böngészőt (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Ezenkívül a folyamatos támogatás érdekében stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
Egyszerre három diából álló körhinta jeleníti meg. Az Előző és a Következő gombokkal egyszerre három dián lépkedhet, vagy a végén lévő csúszkagombokkal egyszerre három dián.
A 2019-es koronavírus-betegség (COVID-19) kitörése óta számos kereskedelmi forgalomban lévő nukleinsav-amplifikációs tesztet (NAAT) fejlesztettek ki szerte a világon, és ezek szabványos tesztekké váltak. Bár számos tesztet gyorsan kifejlesztettek és alkalmaztak a laboratóriumi diagnosztikai vizsgálatokhoz, ezeknek a teszteknek a teljesítményét nem értékelték sokféle környezetben. Ezért ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy értékelje az Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI és Sansure Biotech tesztek teljesítményét a Composite Reference Standard (CRS) segítségével. A vizsgálatot az Etióp Közegészségügyi Intézetben (EPHI) végezték 2020. december 1. és 30. között. 164 orrgaratmintát vettek ki a QIAamp RNA mini kit és az Abbott DNS-minta-előkészítő rendszer segítségével. A 164 minta 59,1%-a volt pozitív és 40,9%-a negatív CRS-re. A Sansure Biotech pozitivitás szignifikánsan alacsony volt a CRS-hez képest (p < 0,05). A Sansure Biotech pozitivitás szignifikánsan alacsony volt a CRS-hez képest (p < 0,05). Положительные результаты Sansure Biotech были значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05). A Sansure Biotech pozitív eredményei szignifikánsan alacsonyabbak voltak a CRS-hez képest (p < 0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）.与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）. У Sansure Biotech было значительно меньше положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). A Sansure Biotech szignifikánsan kevesebb pozitív eredményt ért el a CRS-hez képest (p < 0,05).A négy elemzés összhangja 96,3–100% volt a CRS-hez képest. A Sansure Biotech vizsgálat alacsony pozitivitási aránya mellett a négy teszt teljesítménye szinte összehasonlítható volt. Mint ilyen, a Sansure Biotech [Research Only (RUO)] vizsgálat további validálást igényel az Etiópiában történő használathoz. Végül további kutatásokat kell fontolóra venni a vizsgálatok megfelelő gyártói állításokkal történő értékeléséhez.
A laboratóriumi vizsgálatok az Egészségügyi Világszervezet (WHO) Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) felkészültségi és válaszadási stratégiai tervének (SPRP) részét képezik. A WHO azt tanácsolja, hogy az országoknak laboratóriumi kapacitást kell kiépíteniük a felkészültség, a megfelelő esetkezelés, az éberség és a közegészségügyi kihívásokra való gyors reagálás javítása érdekében. Ez azt sugallja, hogy a laboratórium szerepe kulcsfontosságú a feltörekvő fertőző ágensek betegségének és epidemiológiájának jellemzésében, valamint terjedésük ellenőrzésében.
A COVID-19 diagnózisához epidemiológiai és orvosi információkra, személyes tünetekre/jelekre, valamint radiográfiai és laboratóriumi adatokra van szükség2. A kínai Wuhanban történt COVID-19-járvány bejelentése óta számos kereskedelmi nukleinsav-amplifikációs tesztet (NAAT) fejlesztettek ki világszerte. A valós idejű reverz transzkripciós polimeráz láncreakciót (rRT-PCR) rutin és standard módszerként alkalmazták a súlyos akut légúti szindróma 2 (SARS-CoV-2)3 fertőzés laboratóriumi diagnosztizálására. A SARS-CoV-2 molekuláris kimutatása jellemzően az N (nukleokapszid fehérje gén), E (burokfehérje gén) és RdRp (RNS-függő RNS polimeráz gén) géneken alapul az ORF1a/b-ben (nyitott leolvasási keret 1a/b). . gén) régió azonosítása a vírusgenomból. Ezeket tekintik a vírusgenomokban a vírusfelismerés szempontjából a fő konzervált régióknak4. Ezen gének közül az RdRp és az E gének nagy analitikai detektálási érzékenységgel rendelkeznek, míg az N gén alacsony analitikai érzékenységgel rendelkezik5.
A PCR-vizsgálatok teljesítménye különböző tényezőktől függően változhat, mint például: extrakciós reagensek, amplifikációs/detektáló reagensek, extrakciós módszer, a PCR-gép minősége és egyéb műszerek. 2020 áprilisáig kilenc országból több mint 48 különböző diagnosztikai eszköz kapott sürgősségi használati engedélyt (EUA) a COVID-196 diagnosztizálására. Etiópiában több mint 14 valós idejű PCR platformot használnak a SARS-CoV-2 PCR kimutatására 26 közegészségügyi intézményben, köztük az ABI 7500-ban, az Abbott m2000-ben, a Roche 48000-ben és a Quant-studio7-ben. Ezenkívül különféle PCR tesztkészletek állnak rendelkezésre, mint például a Daan Gene teszt, az Abbott SARS-CoV-2 teszt, a Sansure Biotech teszt és a SARS-CoV-2 BGI teszt. Bár az rRT-PCR rendkívül érzékeny, egyes COVID-19-ben szenvedő betegek álnegatív eredményekről számolnak be, mivel a mintákban nem található elegendő vírusos ribonukleinsav (RNS) másolata a nem megfelelő gyűjtés, szállítás, tárolás és kezelés, valamint laboratóriumi vizsgálatok miatt. a személyzet feltételei és intézkedései8. Ezenkívül a minta vagy a kontroll helytelen kezelése, a ciklusküszöb (Ct) beállítása és más patogén nukleinsavakkal vagy inaktív/maradék SARS-CoV-2 RNS-sel való keresztreaktivitás téves pozitív eredményekhez vezethet az rRT-PCR9 vizsgálatokban. Egyértelmű tehát, hogy a PCR-tesztek valóban képesek azonosítani a génfragmentumok hordozóit, hiszen még a valóban aktív vírusgéneket sem tudják megkülönböztetni, így a tesztek csak a hordozókat tudják azonosítani, a betegeket nem10. Ezért fontos, hogy a diagnosztikai teljesítményt standard módszerekkel értékeljük a környezetünkben. Bár sok NAAT reagens elérhető az Etióp Közegészségügyi Intézetben (EPHI) és az egész országban, még nem számoltak be a hatékonyságuk összehasonlító értékeléséről. Ezért ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy értékelje a SARS-CoV-2 rRT-PCR-rel történő kimutatására szolgáló, kereskedelemben kapható készletek összehasonlító teljesítményét klinikai minták felhasználásával.
A vizsgálatba összesen 164 COVID-19-gyanús résztvevőt vontak be. A minták többsége kezelőközpontból származott (118/164 = 72%), míg a fennmaradó 46 (28%) résztvevő nem kezelőközpontból származott. A központban nem kezelt résztvevők közül 15-nek (9,1%) volt klinikailag gyanús esete, és 31-nek (18,9%) volt kapcsolata igazolt esettel. Kilencvenhárom (56,7%) résztvevő férfi volt, és a résztvevők átlagéletkora (± SD) 31,10 (± 11,82) év volt.
Ebben a vizsgálatban négy COVID-19 teszt pozitív és negatív arányát határozták meg. Így az Abbott SARS-CoV-2 assay, a Daan Gene 2019-nCoV assay, a SARS-CoV-2 BGI assay és a Sansure Biotech 2019-nCoV assay pozitív aránya 59,1%, 58,5%, 57,9% és 55,5% volt. . A pozitív és negatív összetett referencia standard (CRS) pontszám 97 (59,1%) és 67 (40,9%) volt (1. táblázat). Ebben a tanulmányban a CRS meghatározása a „bármilyen pozitív” szabályon alapult, amely szerint négy vizsgálati eredmény közül kettő vagy több ugyanazt az eredményt adó vizsgálati eredményt tekintették valóban pozitívnak vagy negatívnak.
Ebben a tanulmányban 100%-os negatív százalékos megegyezést (NPA) találtunk (95% CI 94,6–100) minden elemzésre a CRS-hez képest. A Sansure Biotechnology elemzése 93,8%-os minimális PPA-t mutatott (95% CI 87,2-97,1), a Daan Gene 2019-nCoV analízis pedig 99,4%-os (95% CI 96,6-99,9) általános egyezést mutatott. Ezzel szemben a SARS-CoV-2 BGI-teszt és a Sansure Biotech 2019-nCoV-teszt közötti általános egyetértés 98,8%, illetve 96,3% volt (2. táblázat).
A CRS és az Abbott SARS-CoV-2 assay eredményei közötti Cohen-féle kappa egyezési együttható teljes mértékben konzisztens volt (K = 1,00). Hasonlóképpen, a Daan Gene 2019-nCoV, a SARS-CoV-2 BGI és a Sansure Biotech 2019-nCoV által kimutatott Cohen-kappa értékek szintén teljes mértékben összhangban vannak a CRS-sel (K ≥ 0,925). Ebben az összehasonlító elemzésben a khi-négyzet teszt (McNemar teszt) azt mutatta, hogy a Sansure Biotech 2019-nCoV teszt eredményei szignifikánsan eltértek a CRS eredményektől (p = 0,031) (2. táblázat).
ábrán látható módon.1 az Abbott SARS-CoV-2 assay (kombinált RdRp és N gén) legalacsonyabb Ct-értékének (< 20 Ct) százalékos aránya 87,6% volt, és a Sansure Biotech 2019-nCoV assay ORF1a/b gén Ct-értéke azt mutatta, hogy az alacsony A Ct érték (< 20 Ct) 50,3%, a magas Ct érték (36-40 Ct) 3,2% volt. 1 az Abbott SARS-CoV-2 assay (kombinált RdRp és N gén) legalacsonyabb Ct-értékének (< 20 Ct) százalékos aránya 87,6% volt, és a Sansure Biotech 2019-nCoV assay ORF1a/b gén Ct-értéke azt mutatta, hogy az alacsony A Ct érték (< 20 Ct) 50,3%, a magas Ct érték (36-40 Ct) 3,2% volt.ábrán látható módon.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6%, еаеначенач ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct (< 20 Ct) составлял 50,3%, а высое6–40t составляло 3,2%. Az 1. ábrán az Abbott SARS-CoV-2 (kombinált RdRp és N gén) legalacsonyabb Ct-értékének (< 20 Ct) analízisének százalékos aránya 87,6%, a Sansure Biotech 2019-nCoV ORF1a/b génanalízisének Ct-értéke pedig azt mutatta. hogy az alacsony Ct értékű (< 20 Ct) százalékos aránya 50,3%, a magas értékű Ct (36–40 Ct) 3,2%-ot tett ki.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20 Ct. 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%，高Ct 值Ct(36)的百分比为3,2%. Amint az 1. ábrán látható, az Abbott SARS-CoV-2 teszt (RdRp és N gén kombinációja) legalacsonyabb százalékos Ct értéke (< 20 Ct) 87,6%, az ORF1a/b gén Ct értéke a Sansure Biotech 2019-nCoV tesztben. alacsony Ct值(< 20 Ct) 的 százalék 50,3%, 高Ct值(36-40 Ct) 的 százalék 3,2%. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp и N) размере 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b в исследовании Sansure Biotech 2019- Анализ nCoV показал низкий Ct. Amint az 1. ábrán látható, az Abbott SARS-CoV-2 vizsgálatban (az RdRp és N géneket kombinálva) volt a legalacsonyabb százalékos Ct érték (< 20 Ct), 87,6%, míg az ORF1a/b gén Ct értéke a Sansure-ban. Biotech 2019 tanulmány – Az nCoV elemzése alacsony Ct-t mutatott. Процент значений (< 20 Ct) составил 50,3%, а процент высоких значений Ct (36–40 Ct) составил 3,2%. Az értékek százalékos aránya (< 20 Ct) 50,3%, a magas Ct értékek (36-40 Ct) százaléka 3,2% volt.Az Abbott SARS-CoV-2 B teszt 30 feletti Ct értékeket regisztrált. Másrészt a BGI SARS-CoV-2 vizsgálatban az ORF1a/b gén magas Ct értékkel (> 36 Ct) 4% volt (1. ábra). Másrészt a BGI SARS-CoV-2 vizsgálatban az ORF1a/b gén magas Ct értékkel (> 36 Ct) 4% volt (1. ábra). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процент которого составрия. Ezzel szemben a BGI SARS-CoV-2 gén elemzése során az ORF1a/b gén magas Ct értékkel (> 36 Ct) rendelkezett, ennek százalékos aránya 4% (1. ábra).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比为 Másrészt a BGI SARS-CoV-2 kimutatásban a magas Ct értékű (>36 Ct) ORF1a/b gén százalékos aránya 4% (1. ábra). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 процент генов ORF1a/b с высокими значениями Ct (>36 Ct) составил 4% (рис.). Másrészt a BGI SARS-CoV-2 elemzésben a magas Ct-értékkel (>36 Ct) rendelkező ORF1a/b gének százalékos aránya 4% volt (1. ábra).
Ebben a vizsgálatban 164 nasopharyngeális mintát vettünk. Minden típusú assay esetében az RNS izolálását és amplifikációját a megfelelő gyártók által javasolt módszerek és kittek alkalmazásával végeztük.
Ez a tanulmány kimutatta, hogy az Abbott SARS-CoV-2-tesztje ugyanolyan észlelési teljesítményt nyújt, mint a CRS, 100%-os pozitív, negatív és általános egyezést mutat. Cohen kappa-megállapodása 1,00, ami a CRS-szel való teljes egyetértést jelzi. Az amerikai Washington Egyetem hasonló tanulmánya szerint az Abbott SARS-CoV-2-teszt általános szenzitivitása és specificitása 93%, illetve 100% volt a CDC laboratóriumilag meghatározott tesztjéhez (LDA) képest. . 11. Az Abbott SARS-CoV-2 detektáló rendszer az N és RdRp gének egyidejű kombinált kimutatásán alapul, mivel mindkét gén érzékenyebb, minimalizálva a hamis negatívokat12. Egy Bécsben (Ausztriában) végzett tanulmány azt is kimutatta, hogy a nagy extrakciós mintatérfogat és a detektáló eluens térfogata minimálisra csökkentette a hígítási hatásokat és növelte a kimutatás hatékonyságát13. Így az Abbott tökéletes illeszkedése a SARS-CoV-2 vizsgálathoz olyan platform-detektáló rendszerhez köthető, amely egyszerre detektálja a kombinatorikus géneket, nagyszámú mintát (0,5 ml) von ki, és nagy mennyiségű eluenst (40 µl) használ.
Eredményeink azt is mutatták, hogy a Daan genetikai teszt detektálási teljesítménye majdnem megegyezik a CRS-ével. Ez összhangban van a kínai Huainanban található Anhui Egyetemen végzett tanulmány14 és a gyártó 100%-os pozitív egyetértésről szóló állításával. A konzisztens eredményekről szóló jelentések ellenére egy minta álnegatív volt ugyanazon eluátum újbóli tesztelése után, de az Abbott SARS-CoV-2 és Sansure Biotech nCoV-2019 tesztekben pozitívnak bizonyult. Ez arra utal, hogy a különböző típusú vizsgálatok eredményeiben eltérések lehetnek. Mindazonáltal a Kínában végzett vizsgálatban15 a Daan Gene assay eredménye szignifikánsan különbözött (p < 0,05) a laboratóriumban meghatározott referenciavizsgálattól. Mindazonáltal a Kínában végzett vizsgálatban15 a Daan Gene assay eredménye szignifikánsan különbözött (p < 0,05) a laboratóriumban meghatározott referenciavizsgálattól. Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значительно отличался (p < 0,05) эталонного анализа. Egy Kínában végzett vizsgálatban15 azonban Daan Gene elemzési eredménye szignifikánsan különbözött (p < 0,05) a laboratóriumi referenciaanalízisétől.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p < 0,05).然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan значительно отличались < он0,05p) его эталонным лабораторным тестом. Egy Kínában végzett vizsgálatban15 azonban Daan genetikai tesztjének eredményei szignifikánsan eltértek (p < 0,05) a referencia laboratóriumi teszthez képest.Ez az eltérés a SARS-CoV-2 kimutatására szolgáló referenciateszt érzékenységéből adódhat, és további vizsgálatok fontosak lehetnek az ok meghatározásához.
Ezenkívül tanulmányunk értékelte a SARS-CoV-2 BGI-teszt összehasonlító teljesítményét a CRS-sel, kiváló pozitív százalékos egyezést (PPA = 97,9%), negatív százalékos egyezést (NPA = 100%) és általános százalékos egyezést nemek szerint ( OPA). ). = 98,8%). Cohen Kappa értékei jó egyezést mutattak (K = 0,975). Hollandiában16 és Kínában15 végzett vizsgálatok következetes eredményeket mutattak. A SARS-CoV-2 BGI teszt egy gén (ORF1a/b) kimutatási teszt 10 µl amplifikációs/kimutatási eluátum felhasználásával. A referenciaeredményeinkkel való jó statisztikai egyezés ellenére az elemzésből két pozitív minta hiányzott (1,22%) a teljes mintából. Ennek óriási klinikai következményei lehetnek az átviteli dinamikára mind a beteg, mind a közösség szintjén.
A tanulmányban szereplő másik összehasonlító elemzés a Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO) vizsgálat volt; az összesített találati arány 96,3% volt. Az egyetértés erősségét a Cohen-féle Kappa értéke is meghatározta, amely 0,925 volt, ami a CRS-szel való teljes egyetértést jelzi. Eredményeink ismét megegyeznek a kínai Changsha-i Central South Egyetemen és a kínai Liuzhou városi Liuzhou Népi Kórház Klinikai Laboratóriumi Osztályán végzett vizsgálatokkal17. Annak ellenére, hogy a fenti jó statisztikai egyezést rögzítettük, a khi-négyzet teszt (MacNemar teszt) kimutatta, hogy a Sansure Biotech assay eredménye statisztikailag szignifikáns eltérést mutat a CRS-hez képest (p < 0,005). Annak ellenére, hogy a fenti jó statisztikai egyezést rögzítettük, a khi-négyzet teszt (MacNemar teszt) kimutatta, hogy a Sansure Biotech assay eredménye statisztikailag szignifikáns eltérést mutat a CRS-hez képest (p < 0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-крийтрийкрий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеет статистически значимое различие по сравнению < с0,00p5. Bár a fenti jó statisztikai egyezést rögzítettük, a khi-négyzet teszt (McNemar teszt) azt mutatta, hogy a Sansure Biotech assay eredménye statisztikailag szignifikáns különbséget mutat a CRS-hez képest (p < 0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性，但卡方检验（MacNemar 检验）表明，RSSansure Biotech.相比具有统计学显着差异（p < 0,005）.尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 表明 棵tech 朞狌 棋 sure （与 crs 相比 具有 显着 （(p <0,005。。。。。。。。。。。。。。。。。）。。。（（（（（（（ Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макнпема) статистически значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech és CRS. A fent említett jó statisztikai egyezés ellenére a khi-négyzet teszt (McNemar teszt) statisztikailag szignifikáns különbséget mutatott (p < 0,005) a Sansure Biotech vizsgálat és a CRS között.Hat minta (3,66%) bizonyult hamis negatívnak a CRS-hez képest (1. kiegészítő táblázat); ez nagyon fontos, különös tekintettel a vírus terjedésének dinamikájára. A fenti adatok is alátámasztják ezt az alacsony észlelési arányt15.
Ebben a vizsgálatban a Ct értékeket minden egyes vizsgálathoz és megfelelő platformhoz meghatározták, és a legalacsonyabb átlagos Ct értéket az Abbott SARS-CoV-2 vizsgálatban jelentették. Ez az eredmény összefüggésbe hozható az Abbott által a SARS-CoV-2 kimutatására szolgáló szimultán kombinált genetikai tesztrendszerrel. Ezért az 1. ábra szerint az Abbott SARS-CoV-2 eredmények 87,6%-ának Ct-értéke 20 alatt volt. Csak kis számú mintaeredmény (12,4%) volt a 20-30 tartományban. 30 feletti Ct értékeket nem rögzítettek. Amellett, hogy az Abbott a SARS-CoV-2 panel genetikai tesztelési formátumát használja, ez az eredmény összefügghet az alsó kimutatási határértékkel (32,5 RNS kópia/ml)18, amely háromszor alacsonyabb, mint a vállalat 100 RNS kópiás alsó határa. /mL. ml)19.
Ennek a tanulmánynak vannak korlátai: egyrészt forráshiány miatt nem rendelkezünk standard/referencia módszerekkel [például vírusterhelés vagy egyéb laboratóriumi vizsgálatok (LDA)]. Másodszor, a vizsgálatban használt összes minta nasopharyngealis tampon volt, míg az eredmények nem voltak alkalmazhatók más mintatípusokra, harmadszor pedig a mintánk mérete kicsi volt.
Ez a tanulmány négy rRT-PCR vizsgálat teljesítményét hasonlította össze a SARS-CoV-2 kimutatására orrgarat minták felhasználásával. A Sansure Biotech assay kivételével minden kimutatási vizsgálat közel hasonló teljesítményt nyújtott. Emellett a Sansure Biotech tesztben a CRS-hez képest alacsony pozitivitási arányt azonosítottak (p < 0,05). Emellett a Sansure Biotech tesztben a CRS-hez képest alacsony pozitivitási arányt azonosítottak (p < 0,05). Кроме того, в тесте Sansure Biotech был выявлен низкий процент положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Ezenkívül a Sansure Biotech teszt alacsony százalékos pozitív eredményt mutatott a CRS-hez képest (p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05). Кроме того, анализ Sansure Biotech имел более низкий уровень положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Ezenkívül a Sansure Biotech vizsgálat alacsonyabb pozitivitási arányt mutatott a CRS-hez képest (p < 0,05).A PPA, az NPA és a teljes megállapodás Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) elemzése meghaladta a 93,5%-ot, a Cohen Kappa megállapodás erőssége 0,925. Végül a Sansure Biotech Assay (RUO) további validálásra szorul az etiópiai használathoz, és további kutatásokat kell fontolóra venni az egyes gyártók állításainak értékeléséhez.
Összehasonlító vizsgálati tervezést végeztek négy egészségügyi intézményben Addis Abebában, az Eka Kotebe Kórházban, a Millenium Church Treatment Centre-ben, a Zewooditu Memorial Hospital-ban és a St. Peter's Tuberculosis Specialist Hospital-ban. Az adatok gyűjtése 2020. december 1. és 31. között történt. A tanulmányhoz az egészségügyi létesítményeket céltudatosan választották ki az esetek magas száma és a város nagyobb kezelőközpontjainak elérhetősége alapján. Hasonlóképpen, a műszereket, köztük az ABI 7500 és az Abbott m2000 valós idejű PCR műszereket a NAAT reagensgyártók ajánlásai alapján választották ki, és négy PCR-detektáló készletet választottak ki ehhez a vizsgálathoz, mivel a legtöbb etiópiai laboratórium legalább legalább négy közülük. A vizsgálat során elvégzett génteszt, Abbott SARS-CoV-2 teszt, Sansure Biotech teszt és SARS-CoV-2 BGI teszt).
A SARS-CoV-2 tesztelését 2020. december 1. és 30. között végezték 3 ml vírusszállító táptalaj (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Kína) felhasználásával olyan személyektől, akiknél a COVID-19 miatt vizsgált, EPHI-re hivatkoztak. A nasopharyngealis mintákat képzett mintagyűjtők gyűjtötték, és hármas csomagokban küldték el az EPHI-hez. A nukleinsav izolálása előtt minden minta egyedi azonosító számot kap. Az extrahálást minden mintából azonnal megérkezéskor végezzük kézi és automatikus extrakciós módszerekkel. Így az Abbott m2000 automatikus extrakciójához minden mintából 1,3 ml mintát (beleértve a 0,8 ml holttérfogatot és a 0,5 ml extrakciós bemeneti térfogatot) extraháltunk, és átengedtük az Abbott DNS-minta-előkészítő rendszeren (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, USA). ) A SARS-CoV-2 (EUA) két körének valós idejű teljes folyamatába (visszakeresés és kimutatás) 96 [92 mintából, két kimutatási kontrollból és két nem sablonból álló kontrollból (NTC)] álló köteg került be. bányászati. Hasonlóképpen a kézi extrakcióhoz használja ugyanazokat a mintákat (automatikus extrakcióhoz és felfedezéshez). Így a folyamat során 140 µl-es mintákat osztottak ki, és a QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Németország) segítségével 24 tételben (beleértve 20 mintát, két vizsgálati kontrollt és két NTC-t) kilenc körben extraháltak. A manuálisan extrahált eluátumokat amplifikáltuk és kimutattuk egy ABI 7500 hőciklussal, SARS-CoV-2 BGI vizsgálattal, Daan Gene vizsgálattal és Sansure Biotech vizsgálattal.
A SARS-CoV-2 vírus RNS automatikus izolálása és tisztítása a mágneses gyöngy elvét követi, Abbott DNS-minta-előkészítő reagensekkel. A minták inaktiválását és a vírusrészecskék szolubilizálását guanidin-izotiocianátot tartalmazó detergenssel végezzük a fehérje denaturálására és az RNáz inaktiválására. Az RNS-t ezután szilícium-dioxiddal szilárd fázisú elválasztással választják el a fehérjétől, azaz a guanidinium-só és a lízispuffer lúgos pH-ja elősegíti a nukleinsavak kötődését a szilícium-dioxidhoz (SiO2). Az öblítési lépés eltávolítja a megmaradt fehérjéket és a törmeléket, hogy tiszta oldatot kapjon. Az átlátszó RNS-t szilícium-dioxid alapú mikrorészecskékből izolálják a műszer mágneses tere segítségével20,21. Másrészt az RNS kézi izolálása és tisztítása spin oszlopos módszerrel történik, mágneses állvány helyett centrifugálással és a mikrorészecskék elválasztásával az eluensből.
Az Abbott Real-Time SARS-CoV-2 detektálási tesztet (Abbott Molecular, Inc.) a gyártó utasításai szerint végezték el, amely EUA19,22-t kapott a WHO-tól és az FDA-tól. Ebben a protokollban a minta extrakció előtti inaktiválását vízfürdőben, 56 °C-on 30 percig végeztük. A vírus inaktiválása után a nukleinsav extrakciót Abbott m2000 SP készüléken végeztük 0,5 ml VTM-ből, Abbott m2000 DNS minta-előkészítő rendszerrel. a gyártó szerint. Az amplifikációt és detektálást Abbott m2000 RT-PCR műszerrel, az RdRp és N gének kettős detektálását végeztük. ROX) és VIC P (védett festék) a belső kontrollok célzására és kimutatására, lehetővé téve mindkét amplifikációs termék egyidejű kimutatását 19 .
Ennek a kitnek az amplifikáció-detektálási módszere egylépéses RT-PCR technológián alapul. Az ORF1a/b és N géneket a Daan Gene Technology konzervált régióként választotta ki a célrégió amplifikációjának kimutatására. Specifikus primereket és fluoreszcens próbákat (FAM-mal jelölt N génpróbák, VIC-vel jelölt ORF1a/b próbák) terveztek a SARS-CoV-2 RNS kimutatására a mintákban. A végső eluenst és a mesterkeveréket úgy állítottuk elő, hogy 5 µl eluenst adtunk 20 µl mesterkeverékhez 25 µl végtérfogatig. Az amplifikációt és a detektálást egyidejűleg hajtottuk végre egy ABI 750024 valós idejű PCR készüléken.
Az ORF1a/b és N géneket a Sansure Biotech nCoV-2019 Nucleic Acid Diagnostic Kit (fluoreszcens PCR kimutatás) segítségével detektáltuk. Készítsen specifikus próbákat minden egyes célgénhez úgy, hogy kiválasztja a FAM csatornát az ORF1a/b régióhoz és a ROX csatornát az N génhez. Ehhez a vizsgálati készlethez az eluenst és a master mix reagenseket a következők szerint adjuk: készítsen elő 30 µl master mix reagenst és 20 µl eluált mintát a kimutatáshoz/amplifikációhoz. A valós idejű PCR ABI 750025-öt használtuk az amplifikációhoz/kimutatáshoz.
A SARS-CoV-2 BGI teszt egy fluoreszcens, valós idejű rRT-PCR készlet a COVID-19 diagnosztizálására. A célrégió a SARS-CoV-2 genom ORF1a/b régiójában található, amely egyetlen gén kimutatási módszere. Ezenkívül a humán háztartási gén, a β-aktin egy belsőleg szabályozott célgén. A mesterkeveréket úgy készítik el, hogy 20 µl master mix reagenst és 10 µl extrahált RNS-mintát keverünk össze egy lyukú lemezen26. Az amplifikációhoz és kimutatáshoz ABI 7500 fluoreszcens kvantitatív valós idejű PCR műszert használtunk. Az összes nukleinsav-amplifikációt, a PCR futtatási körülményeit minden egyes vizsgálathoz és az eredmények értelmezését a megfelelő gyártó utasításai szerint végeztük (3. táblázat).
Ebben az összehasonlító elemzésben nem használtuk a referencia standard módszert a százalékos egyezés (pozitív, negatív és összesített) és egyéb összehasonlítási paraméterek meghatározására a négy elemzéshez. Minden teszt-összehasonlítás CRS-sel történt, ebben a vizsgálatban a CRS-t az „bármilyen pozitív” szabály szerint állítottuk be, és az eredményt nem egyetlen teszttel határoztuk meg, hanem legalább két egyező teszteredményt használtunk. Ezenkívül a COVID-19 átvitele esetén a hamis negatív eredmények veszélyesebbek, mint a hamis pozitív eredmények. Ezért ahhoz, hogy a lehető legpontosabban „pozitív” legyen a CRS-eredményből, legalább két vizsgálati tesztnek pozitívnak kell lennie, ami azt jelenti, hogy legalább egy pozitív eredmény valószínűleg egy EUA-tesztből származik. Így a négy vizsgálati eredmény közül kettő vagy több azonos eredményt adó vizsgálati eredmény minősül valóban pozitívnak vagy negatívnak18,27.
Az adatokat strukturált adatkinyerési űrlapokkal gyűjtöttük, az adatbevitelt és elemzést Excel statisztikai szoftverrel, valamint az SPSS 23.0-s verziójával végeztük a leíró statisztikákhoz. Pozitív, negatív és általános százalékos egyezést elemeztünk, és Kappa pontszámot használtunk az egyes módszerek CRS-sel való egyezés mértékének meghatározására. A kappa értékeket a következőképpen értelmezzük: 0,01-0,20 az enyhe egyetértés, 0,21-0,40 az általános egyetértés, 0,41-0,60 a közepes egyetértés, 0,61-0,80 a nagy egyetértés és 0,81-0,99 a teljes egyetértés28.
Az etikai engedélyt az Addisz-Abebai Egyetemtől szerezték be, és ehhez a vizsgálathoz minden kísérleti protokollt jóváhagyott az Etióp Közegészségügyi Intézet Tudományos Etikai Felülvizsgáló Testülete. Az EPHI etikai licenc hivatkozási száma: EPHI/IRB-279-2020. Minden módszert a COVID-19 kezelésére vonatkozó etióp nemzeti átfogó iránymutatás ajánlásaival és rendelkezéseivel összhangban alkalmaztak. Ezenkívül a vizsgálatban való részvételt megelőzően minden vizsgálati résztvevőtől írásos beleegyezést kaptak.
A tanulmányban nyert vagy elemzett összes adat megtalálható ebben a publikált cikkben. A tanulmány eredményeit alátámasztó adatok ésszerű kérésre rendelkezésre állnak a megfelelő szerzőtől.
Egészségügyi Világszervezet. Javaslatok a COVID-19-re vonatkozó laboratóriumi vizsgálati stratégiákhoz: Ideiglenes útmutató, 2020. március 21., WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (WHO, 2020).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI COVID-19 intelligens diagnózis a sürgősségi osztályon: minden a gyakorlatban. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI COVID-19 intelligens diagnózis a sürgősségi osztályon: minden a gyakorlatban.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. és Gurgulianis, KI A COVID-19 intelligens diagnózisa a sürgősségi osztályon: minden a gyakorlatban.Muliou DS, Pantazopoulos I. és Gurgulyanis KI A COVID-19 intelligens diagnózisa a sürgősségi osztályokon: végpontok közötti integráció a gyakorlatban. Szakértő Reverend Respire. gyógyszer. 3, 263–272 (2022).
Mitchell, SL & St George, K. A COVID19 ID NOW EUA vizsgálat értékelése. Mitchell, SL & St George, K. A COVID19 ID NOW EUA vizsgálat értékelése.Mitchell, SL és St. George, K. A COVID19 ID NOW EUA assay értékelése.Mitchell SL és St. George K. A COVID19 ID NOW EUA assay értékelése. J. Clinical. Vírus. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
WHO. A 2019-es koronavírus-betegség (COVID-19) laboratóriumi kimutatása feltételezett emberi betegségben. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (Hozzáférés: 2020. augusztus 15.) (WHO, 2020).
Udugama, B. et al. COVID-19 diagnózis: betegségek és tesztelési eszközök. ACS Nano 14(4), 3822–3835 (2020).
Syed S. et al. A Kelet-, Közép- és Dél-Afrikai Pathológusok Kollégiumának – a Közel-Kelet és Dél-Afrika Regionális Pathológiai Iskola – megalapítása. Afrika. J. Lab. gyógyszer. 9 (1), 1-8 (2020).
Etióp Közegészségügyi Intézet, Szövetségi Egészségügyi Minisztérium. Ideiglenes nemzeti stratégia és útmutató a COVID-19 laboratóriumi diagnosztizálásához. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (Hozzáférés: 2020. augusztus 12.) (EPHI, 2020).
Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Hamis negatív tesztek a SARS-CoV-2 fertőzés kihívásaira és következményeire. Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Hamis negatív tesztek a SARS-CoV-2 fertőzés kihívásaira és következményeire.Voloshin S., Patel N. és Kesselheim AS Hamis negatív tesztek SARS-CoV-2 fertőzésekre és következményeikre.Voloshin S., Patel N. és Kesselheim AS Hamis negatív tesztek a SARS-CoV-2 fertőzés provokációjára és hatására. N. eng. J. Medicine. 383. (6), e38 (2020).
Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Hamis pozitív és álnegatív COVID-19 esetek: Légúti megelőzési és kezelési stratégiák, oltás és további perspektívák. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Hamis pozitív és álnegatív COVID-19 esetek: Légúti megelőzési és kezelési stratégiák, oltás és további perspektívák. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI. вакцинация и дальнейшие перспективы. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI A COVID-19 álpozitív és hamis negatív esetei: légúti megelőzési és kezelési stratégiák, védőoltás és a továbblépés.Muliu, DS és Gurulianis, KI A COVID-19 álpozitív és álnegatív esetei: stratégiák a légúti megelőzésre és kezelésére, védőoltások és a továbblépés. Szakértő Reverend Respire. gyógyszer. 15(8), 993–1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. COVID-19 diagnózis a sürgősségi osztályon: Látja a fát, de elveszíti az erdőt. Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. COVID-19 diagnózis a sürgősségi osztályon: Látja a fát, de elveszíti az erdőt.Mouliou, DS, Ioannis, P. és Konstantinos, G. COVID-19 diagnózis a sürgősségi osztályon: Lásd a fát, veszítsd el az erdőt.Muliou DS, Ioannis P. és Konstantinos G. COVID-19 diagnózis a sürgősségi osztályokon: Nincs elég erdő a fáknak. Megjelenik. gyógyszer. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. et al. Az Abbott RealTime SARS-CoV-2 Assay analitikai és klinikai teljesítményének validálása és validálása. J. Clinical. Vírus. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Öt primerkészlet összehasonlítása a COVID-19 különböző genomrégióiból a vírusfertőzés kimutatására hagyományos RT-PCR-rel. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. A COVID-19 különböző genomrégióiból származó öt primerkészlet összehasonlítása a vírusfertőzés kimutatására hagyományos RT-PCR-rel.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. és Aflatunyan, B. A COVID-19 genom különböző régióiból származó primerek öt készletének összehasonlítása a vírusfertőzés kimutatására hagyományos RT-PCR-rel. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. 比较来自COVID-19不同基因组区域的五个引物组，用于通过常规RT-PCR 检测病毒感染. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. A COVID-19 5 különböző genetikai régiójának összehasonlítása a vírusfertőzés kimutatására hagyományos RT-PCR segítségével.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. és Aflatunyan B. A COVID-19 genom különböző régióiból származó öt primerkészlet összehasonlítása a vírusfertőzés kimutatására hagyományos RT-PCR-rel.Irán. J. Mikrobiológia. 12 (3), 185 (2020).
Goertzer, I. et al. A SARS-CoV-2 genomszekvenciák kimutatására irányuló nemzeti külső minőségértékelési program előzetes eredményei. J. Clinical. Vírus. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. et al. Öt RT-PCR készlet hatékonyságának analitikai értékelése súlyos akut légzőszervi szindróma koronavírus esetén 2. J. Clinical. laboratórium. végbélnyílás. 35. cikk (1), e23643 (2021).
Wang B. et al. Hét kereskedelemben kapható SARS-CoV-2 RNS-detektáló készlet értékelése Kínában valós idejű polimeráz láncreakció (PCR) alapján. klinikai. Kémiai. laboratórium. gyógyszer. 58. cikk (9), e149–e153 (2020).
van Casteren, PB et al. Hét kereskedelmi forgalomba hozott RT-PCR COVID-19 diagnosztikai készlet összehasonlítása. J. Clinical. Vírus. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu és mtsai. A SARS-CoV-2 nukleinsavak kimutatására szolgáló két PCR kit diagnosztikai teljesítményének összehasonlítása. J. Clinical. laboratórium. végbélnyílás. 34. cikk (10), e23554 (2020).
Lefart, PR stb. Négy SARS-CoV-2 nukleinsav-amplifikációs teszt (NAAT) platformon végzett összehasonlító vizsgálat kimutatta, hogy az ID NOW teljesítménye jelentősen romlott a betegtől és a minta típusától függően. diagnózis. mikrobiológia. Megfertőzni. diss. 99 (1), 115200 (2021).
Abbott molekula. Abbott valós idejű SARS-CoV-2 elemzési csomagismertető. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (2020. augusztus 10-i állapot) (2020).
Klein, S. et al. SARS-CoV-2 RNS izolálás mágneses gyöngyökkel a gyors, nagy léptékű kimutatáshoz RT-qPCR és RT-LAMP segítségével. Virus 12(8), 863 (2020).